一、標準操作規(guī)程的確認以及人員培訓(xùn)

標準操作規(guī)程(SOP)是指導(dǎo)操作人員進行某項操作的書面程序，是操作人員的操作標準，是生產(chǎn)操作成功的關(guān)鍵。標準操作規(guī)程應(yīng)能對操作人員提供足夠的指導(dǎo)以完成本項操作。

標準操作規(guī)程應(yīng)由技術(shù)人員編寫，部門主管審閱，質(zhì)量保證部主管批準。將批準后的標準操作規(guī)程對操作人員進行培訓(xùn)，使之真正理解并能熟練掌握。標準操作規(guī)程的原件及培訓(xùn)記錄存放在資料管理部門，操作現(xiàn)場存放的是復(fù)印件。驗證前應(yīng)確認每一項操作有標準可依，以免造成管理上的漏洞，且確認這項操作已被培訓(xùn)過，同時操作人員已能熟練掌握。

驗證之前應(yīng)對所有的操作人員和質(zhì)量管理人員培訓(xùn)與驗證有關(guān)的各項操作(可根據(jù)驗證方案和SOP)，以避免驗證過程中有關(guān)人員不理解甚至不知道怎么做，保證驗證的順利實施。如果生產(chǎn)車間新增加或調(diào)換的無菌操作人員超過20%，應(yīng)重新做無菌工藝驗證，以保證無菌操作能順利進行。

二、儀表校正

儀表校正應(yīng)由有資格的人員或單位按照公司批準過的SOP來進行，并符合國家可追蹤的標準。儀表的校正頻率至少符合國家規(guī)定，并根據(jù)使用頻率調(diào)整并嚴于此標準。使用頻率越高，儀表的磨損越厲害，校正頻率就應(yīng)越高。由于使用沒有經(jīng)過校正的儀表，所得的數(shù)據(jù)無效。

三、工藝條件

無菌原料藥的生產(chǎn)工藝具有其自己的特點：設(shè)備種類多、設(shè)備復(fù)雜、管路長，且不同的生產(chǎn)工藝有不同的特：點，根據(jù)各自的特點選擇固體或液體模擬介質(zhì)。雖然，已盡量地減少設(shè)備的內(nèi)部暴露和減少物料產(chǎn)品的暴露，但是不可避免地會有一些設(shè)備與外界環(huán)境相通，或是物料暴露在環(huán)境中，這些開口處應(yīng)有呼吸器或百級層流空氣的保護，更好的是使用隔離器保護。驗證時，應(yīng)有模擬這些物料暴露的操作。

有些生產(chǎn)工藝中具有結(jié)晶的操作，這使得模擬過程有些困難，因為結(jié)晶過程中有相變產(chǎn)生，應(yīng)該考慮這種變化是否會影響到微生物的生長。最好的辦法是選擇兩種模擬介質(zhì)，它們在結(jié)晶過程發(fā)生反應(yīng)生成另一種模擬介質(zhì)。選擇這樣的介質(zhì)可能會有很大困難，簡單起見，也可用同一種液體模擬介質(zhì)模擬結(jié)晶過程流經(jīng)所有管路加到結(jié)晶罐中。若結(jié)晶過程有加晶種的操作，模擬過程中也應(yīng)有這樣的操作。晶種可用模擬介質(zhì)代替。為使晶體粒度均勻，有些結(jié)晶過程有降溫過程，在模擬過程中不應(yīng)降溫，因為微生物在低溫下不易生長。

干燥過程中的溫度一般 會抑制微生物生長，甚至將微生物殺死，在模擬過程中應(yīng)保持室溫，以免溫度太高殺死細菌而使驗證失敗。也有用冷凍干燥除去濕分的，模擬凍干參數(shù)的選擇也不應(yīng)使細菌的生長受到抑制。

總之，在驗證過程中盡量使工藝參數(shù)和實際情況一致，但是為了使微生物生長良好，允許選擇的工藝參數(shù)和實際情況不一致，?但是這些參數(shù)不應(yīng)和生產(chǎn)工藝產(chǎn)生重大差別。無菌原料藥的分裝劑量一般較大，在這種情況下分裝過程中應(yīng)減慢分裝速度，以增加產(chǎn)品暴露的可能，在最差狀況進行操作。

在進行驗證時，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)過程中曾經(jīng)出現(xiàn)的異常情況或者可以預(yù)想的可能的異常情況設(shè)置最差條件，以考察生產(chǎn)過程中出現(xiàn)此異常情況時產(chǎn)品的無菌性質(zhì)是否會受到影響。

四、操作時限

在原料藥的生產(chǎn)中，每一操作都應(yīng)有操作時限來保證已滅菌的物品避免受到微生物的污染或產(chǎn)品降解。操作時限越長，產(chǎn)品受污染的幾率越大。

在無菌工藝驗證時，應(yīng)將操作時限調(diào)整至最大，在最差狀況下操作如果這時驗證結(jié)果可靠，那么在小于此時間下進行的操作當然也是可靠的。尤其是已滅菌物品由滅菌到使用時的保存時間更加重要。在驗證時，應(yīng)將已滅菌物品至少放置到規(guī)定的保存時間，這樣的驗證結(jié)果更具說服力。每一步操作都應(yīng)延長甚至超過操作時限，這樣會使得總的工藝時間很長，但是這樣的驗證結(jié)果更能保證正常生產(chǎn)時的無菌狀態(tài)。

五、環(huán)境監(jiān)測

在驗證過程中環(huán)境的質(zhì)量至關(guān)重要，應(yīng)在惡劣的環(huán)境下進行操作，但是不能惡劣到使產(chǎn)品發(fā)生染菌的程度。一般采用增加操作人員數(shù)量的辦法惡化環(huán)境。應(yīng)對環(huán)境進行監(jiān)測以評價驗證過程，所有暴露產(chǎn)品的操作都應(yīng)同時監(jiān)測本區(qū)域的環(huán)境。環(huán)境監(jiān)測包括以下幾個項目：無菌室的溫度、濕度、塵埃粒子、沉降菌、浮游菌、人員和表面微生物。

沉降菌和浮游菌用培養(yǎng)皿進行測試，培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿應(yīng)放置在微生物監(jiān)測史上情況最差的部位。在驗證過程中應(yīng)增加取樣的頻率，并且應(yīng)在分裝區(qū)域放有2個以上的取樣培養(yǎng)皿連續(xù)暴露取樣，暴露時間應(yīng)為分裝的全過程，但不宜超過4h，否則營養(yǎng)瓊脂變干而不能提供足夠的營養(yǎng)使細菌不能長出。若工藝時間超出4h，應(yīng)重新放置一個新的培養(yǎng)皿進行監(jiān)測。營養(yǎng)瓊脂在使用前應(yīng)做微生物生長促進試驗，以保證營養(yǎng)瓊脂對微生物生長的適應(yīng)性。

方法如下：選擇合適數(shù)量的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(此數(shù)量具有統(tǒng)計學(xué)意義)，分別接種10~100 CFU的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲得和環(huán)境中的檢出菌。細菌分別置于(32.5±2.5)℃的環(huán)境中培養(yǎng)不超過3天，真菌置于(22.5±2.5)℃的環(huán)境中，分別培養(yǎng)不超過5天。接種的微生物生長良好。測試浮游菌可以用縫隙一瓊脂撞擊采樣法、離心采樣法、液體撞擊采樣法及膜過濾法。一般說來，浮游菌比沉降菌更能反映環(huán)境的質(zhì)量。表面微生物的測試可用擦拭法或Rodac碟。擦拭法用于非規(guī)則表面的微生物測試，用擦拭法測表面微生物之前應(yīng)先測回收率。影響回收率的因素很多，包括微生物的種類和數(shù)量，不同的操作人員進行測試會得到不同的回收率，主要原因是擦拭時用力的大小，每個測試操作人員有自己的回收率數(shù)值。測試回收率時，不要選擇生命脆弱的微生物，因為這些微生物被擦拭時會死去，產(chǎn)生不可信的結(jié)果。用Rodac碟測試規(guī)則表面的微生物污染程度比較方便，但是這種測試會有營養(yǎng)物質(zhì)殘留在被測試的表面，應(yīng)清洗干凈，否則這是一個很大的污染。塵埃粒子盡可能使用在線監(jiān)測，取樣點數(shù)和取樣量符合現(xiàn)行的法規(guī)的要求，監(jiān)測的結(jié)果應(yīng)能證明在產(chǎn)品暴露的關(guān)鍵區(qū)域空氣質(zhì)量達到了100級潔凈區(qū)的空氣質(zhì)量標準。

六、工藝過程的模擬和全培養(yǎng)

由于一般原料藥生產(chǎn)工藝都經(jīng)過結(jié)晶過程，其間會發(fā)生相變，因此無菌工藝驗證不可能完全按照原來的實際工藝來進行模擬。

從原材料配制起，以培養(yǎng)基作為模擬介質(zhì)，經(jīng)過除菌過濾、結(jié)晶、過濾、洗滌幾個步驟后，為了保證所用的介質(zhì)是全部用于無菌檢驗，需要對多余的模擬介質(zhì)采取措施進行全量培養(yǎng)，以保證所用介質(zhì)的完整性。以后的干燥、粉碎、分裝步驟再按生產(chǎn)工藝進行。為了考察各步驟的無菌狀況，要在各個階段進行取樣，模擬生產(chǎn)過程中的取樣，不要刻意地增加取樣點。取樣的樣品也要進行培養(yǎng)，以達到全面培養(yǎng)的目的。為了保證取樣的無菌性，對取樣口進行滅菌，如果不能使用蒸汽滅菌，可以使用殺孢劑滅菌，但在取樣前要保證殺孢子劑殘留沒有抑菌性。

生產(chǎn)過程中可能有升溫、降溫過程，此時應(yīng)注意模擬介質(zhì)對溫度的敏感性。可通過實驗室考察。

七、樣品培養(yǎng)

陰性對照：在驗證過程中，隨機取出有代表性的一定數(shù)量的裝有培養(yǎng)基的包裝容器作為陰性對照。陽性對照：驗證過程中，隨機取出有代表性的一定數(shù)量的裝有模擬介質(zhì)的包裝容器，1/3接種濃度為<100 CFU的5種標準菌株和環(huán)境的檢出菌，接種后細菌在(32.5±2.5) ℃環(huán)境下培養(yǎng)48~72 h，霉菌和酵母菌在225±2.5)℃培養(yǎng)5天，接種包裝容器中均有明顯的所接種微生物的生長，以此作為陽性對照。

樣品培養(yǎng)：將分裝得到的產(chǎn)品在操作現(xiàn)場灌裝培養(yǎng)基，然后密封，檢查密封性。全部產(chǎn)品應(yīng)在(22.5±2.5)℃和(32.5±2.5)℃分別培養(yǎng)7天，總培養(yǎng)14天，每天檢查全部樣品的微生物生長情況。若發(fā)現(xiàn)污染應(yīng)注明批號、包裝容器號，同時檢查密封情況。若有破損注明原因。污染的樣品應(yīng)做微生物鑒別，鑒別到種。

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