一、PCR實(shí)驗(yàn)室的清潔消毒

（1）PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)置試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物和擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)4個工作區(qū)城，4個區(qū)域必須是相互獨(dú)立的，不能直通，應(yīng)有緩沖間供工作人員換工作服和鞋，并且有明確的標(biāo)志，進(jìn)入各工作區(qū)域嚴(yán)格按照從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)單一方向進(jìn)行。

（2）各區(qū)有完善的相應(yīng)設(shè)備，儀器設(shè)備和所有物品必須嚴(yán)格分開，不得混用，不同的工作區(qū)域使用不同顏色的工作服.工作人員離開時不得將工作服帶出。在整個PCR實(shí)驗(yàn)操作過程中，工作人員都必須戴上手套，并經(jīng)常更換，還要求工作人員戴口罩，避免在處理樣本時對人體造成污染，保證工作人員的身體安全。每次實(shí)驗(yàn)前應(yīng)作好吸嘴Eppendorf管、反應(yīng)管和加樣器等物品的高壓消毒，各工作區(qū)域的地面用10%次氯酸鈉消毒，打開排風(fēng)扇使各區(qū)的空氣流通。

（3）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑分裝和主反應(yīng)混合液的制備都應(yīng)在該區(qū)完成。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆帽苊庥捎诮?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。目前本科室使用的試劑盒反應(yīng)液是廠家配好的，單人單管只需從此區(qū)移至下一個工作區(qū)域。工作結(jié)東后必須立即對工作區(qū)域進(jìn)行清潔消毒，實(shí)驗(yàn)室的桌椅表面每次工作后也要清潔，實(shí)驗(yàn)室的空氣消毒打開房項(xiàng)的紫外燈照射。

（4）標(biāo)本制備區(qū)：標(biāo)本處理對核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的提取方法，選擇好的試劑品牌是一個很關(guān)鍵的問題，試劑質(zhì)量的好壞直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。臨床標(biāo)本都集中在本區(qū)，實(shí)驗(yàn)操作過程中一定要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室操作流程，特別在加樣中，空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動，為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管，防止溶液外濺。工作結(jié)束后必須立即對實(shí)驗(yàn)臺表面、加樣器、有機(jī)玻璃試管架，離心機(jī)，首先用10%次氯酸鈉消毒，然后用70%乙醇清潔，另外，實(shí)驗(yàn)臺表面使用254nm波長可移動紫外燈，距離實(shí)驗(yàn)臺上60~90 cm內(nèi)長時間照射照射過夜更好。用過的吸嘴必須放人專用的含次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡，實(shí)驗(yàn)室的桌椅表面每次工作后也要清潔，實(shí)驗(yàn)室的空氣消毒同樣打開房頂?shù)淖贤鉄粽丈洹?/span>

（5）擴(kuò)增區(qū)：DNA擴(kuò)增不能從本區(qū)再進(jìn)人任何“上游”區(qū)城，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出，本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。本區(qū)工作后的清潔消毒和紫外燈照射方法與前面區(qū)域相同。

二、PCR實(shí)驗(yàn)室的防污染措施

（1）污染原因：①擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是 PCR反應(yīng)中最主要也是最常見的污染問題。因?yàn)?/span>PCR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以，極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽性。實(shí)驗(yàn)材料如重組克隆的DNA或者來自同一次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣器，容器及其他溶液被PCR核酸模板污染。②測試樣品污染：收集標(biāo)本的容器被污染或標(biāo)本放置時由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于加樣器污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。③氣溶膠污染：最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較刷烈地?fù)u動反應(yīng)管開蓋時、吸樣時及污染加樣器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個氣溶膠顆?？珊?/span>48 000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。另外，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、試劑及任何與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的東西，都是污染的來源。

（2）防污染措施：PCR 實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格分區(qū)：將實(shí)驗(yàn)室分為4個工作區(qū)域并嚴(yán)格按照從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)單一方向順序進(jìn)行。各區(qū)必須相互獨(dú)立，儀器設(shè)備和各種物品嚴(yán)格分開，不能串用。分裝PCR試劑：當(dāng)使用的PCR試劑盒，不是獨(dú)立分裝的反應(yīng)液時，應(yīng)將PCR反應(yīng)液預(yù)先配制好。然后分裝到反應(yīng)管-20℃保存，以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會。PCR試劑、PCR反應(yīng)液與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，試劑盒電面的陽性對照、陽性參考品也應(yīng)該與試劑分開放置，不應(yīng)放于同一冰箱。正確使用加樣器：吸樣時要特別小心應(yīng)緩慢勻速，避免液體濺到加樣器頭上，盡量一次性吸完，忌反復(fù)多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠。打出液體后拇指不應(yīng)松開按鈕，將吸嘴壓掉后冉將拇指松開，避免液體回吸。實(shí)驗(yàn)前后按要求作好實(shí)驗(yàn)室的清潔消毒工作，特別是實(shí)驗(yàn)完成后，消毒工作一定要徹底，破壞殘留的DNA防止操作人員污染，使用一次性手套，吸嘴、Eppendorf管和反應(yīng)管也應(yīng)該一次性使用。Eppendorf管的質(zhì)量也不容忽視，好質(zhì)量的(有齒輪)Eppendorf管，管蓋密封嚴(yán)實(shí)，避免樣本外溢和外來核酸的進(jìn)入。打開之前應(yīng)先離心，將管壁和管蓋上的液體甩至管底開蓋時動作要輕以防管內(nèi)液體濺出，造成污染。應(yīng)設(shè)陽性對照和陰性對照，選擇拷貝在臨界值的弱陽性作陽性對照，并注意交叉污染的可能性，每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照，以監(jiān)測試劑是否污染，還應(yīng)帶一個不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。

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